İstanbul’un fethi ile Fatih Sultan Mehmet, ilk namazı Ayasofya Camii’nde kılmıştır. Fethin sembollerinden biri haline gelen bu özel ve gizemli yapıda 86 yıl sonra cemaat Cuma namazını eda edecek. Ayasofya tarihinden mabedin yapımında 1000 usta ve 10.000 işçi ile beraber 5 yıl gibi bir sürede tamamlanmıştır. Tarihi yarımada da bulunana Ayasofya Camii, 1500 yıllık bir tarihe sahiptir.
İstanbul tarihi yarımada da bulunan Ayasofya, İstanbul’da yapılmış en büyük Bizans kilisesi olup, aynı yerde üç kez inşaa edilmiştir.İlk yapıldığında Megale Ekklesia (Büyük Kilise ) adını almış, V. yüzyıldan itibaren ise Hagia Sophia (Kutsal Hikmet) olarak adlandırılmıştır.
I. Kilise İmparator Constantinos ’un (324–337) oğlu imparator Constantios (337–361) tarafından 360 yılında yaptırılmıştır. Bu kilise bazilikal planlı ve ahşap çatılıdır. Kilise 404 yılında İmparator Arcadios’a karşı, çıkan halk ayaklanmasında kısmen yakılmış ve harap olmuştur.
II. Kilise İmparator II. Theodosios (408–450) tarafından Mimar Ruffinos ’a 415 yılında inşaa ettirilmiştir. Bu yapı da yine bazilikal planlı, ahşap çatılı, 5 nefli ve 3 kapılı anıtsal girişli bir yapıdır. II. Ayasofya da İmparator Iustinianos ( 527–565) aleyhine 532 yılında başlayan ve tarihte Nika ayaklanması olarak adlandırılan isyan sonucunda yanmış ve yıkılmıştır.
Bugünkü Ayasofya İmparator Iustinianos tarafından dönemin iki önemli mimarı olan Miletos’lu (Milet) Isidoros ile Tralles’li (Aydın) Anthemios ’a yaptırılmıştır.
Binanın yapımına 23 Şubat 532 tarihinde başlanmış,1000 usta ve 10.000 işçi ile 5 yılda tamamlanmış, 27 Aralık 537 yılında ibadete açılmıştır.
Ayasofya’da VI. yüzyılda yapılan orjinal tavan mozaiklerinin bitkisel ve geometrik motifli olanları günümüze kadar ulaşmış, ancak tasvirli mozaikler ikonaklazma akımının bitiminden sonra yapılmıştır.
1453’te kilise camiye dönüştürüldükten sonra Osmanlı sultanı Fatih Sultan Mehmet’in gösterdiği hoşgörüyle mozaiklerinden insan figürleri içerenler tahrip edilmemiş (içermeyenlerse olduğu gibi bırakılmıştır), yalnızca ince bir sıvayla kaplanmış ve yüzyıllarca sıva altında kalan mozaikler, bu sayede doğal ve yapay tahribattan kurtulabilmiştir.
Cami, müzeye dönüştürülürken sıvaların bir kısmı çıkarılmış ve mozaikler yine gün ışığına çıkarılmıştır.
2016'da tekrar açılan dava da Haziran 2018'de açıklanan karar ile aynı şekilde sonuçsuz kaldı. Temmuz 2016'da Ayasofya Müzesi'nde düzenlenen Kadir Gecesi programında, 85 yıl aradan sonra sabah namazı ezanı okundu.
Ekim 2016'da Müze'nin ibadete açık olan bölümü Hünkar Kasrı'na, Diyanet İşleri Başkanlığı tarafından uzun yıllardan sonra ilk kez asaleten imam atandı. 2016 itibarıyla Hünkar Kasrı bölümünde vakit namazlar kılınmaya ve minarelerinden Sultanahmet Camii ile 5 vakit çifte ezan okunmaya başlandı.
29 Mayıs 2020 tarihinde İstanbul'un Fethinin 567. yıl dönümünde Fetih Suresi okundu. Bu gelişmelerin ardından Ayasofya'nın cami olma süreci tekrar gündeme geldi.
Sürekli Vakıflar Tarihi Eserlere ve Çevreye Hizmet Derneği'nin "Ayasofya'nın camiden müzeye dönüştürülmesine yönelik Bakanlar Kurulu kararının iptali" istemiyle Danıştay'da dava açması üzerine 2 Temmuz 2020 tarihinde duruşma gerçekleştirildi.
10 Temmuz 2020 tarihinde Danıştay 10. Dairesi, Ayasofya'nın camiden müzeye dönüştürülmesine dair 24 Kasım 1934 tarihli Bakanlar Kurulu kararını "Ayasofya'nın vakıf senedindeki cami vasfı dışında kullanımının ve başka bir amaca özgülenmesinin hukuken mümkün olmadığını" belirterek iptal etti.
Bunun üzerine 2729 numaralı Cumhurbaşkanlığı Kararı ile Ayasofya, Diyanet İşleri Başkanlığı'na devredilerek tekrar cami statüsüne dönmüş oldu.